本期簡(jiǎn)介：

  單克隆抗體（mAb）具有靶向性強(qiáng)、特異性高和毒副作用低等特點(diǎn)，目前已經(jīng)成功用于治療免疫、癌癥等多種疾病領(lǐng)域。本期小貝想要介紹給大家如何快速、、準(zhǔn)確的篩選到高親和性的單克隆，以及如何提高抗體親和力助于改善抗體的特異性和效力，減少用藥劑量降低毒副作用等都是抗體藥物研發(fā)的關(guān)注熱點(diǎn)。

其中親和力是抗體藥物是否具有藥效的關(guān)鍵功能屬性之一，Binding和Function是藥效初步評(píng)價(jià)中重要的兩環(huán)，對(duì)于候選藥物來(lái)說(shuō)，結(jié)合是其藥物發(fā)揮功能的必要條件。但在mAb的產(chǎn)生過(guò)程中，蛋白質(zhì)的翻譯后修飾會(huì)產(chǎn)生差異導(dǎo)致各種糖型的產(chǎn)生。如果在治療劑的生產(chǎn)中使用不同的細(xì)胞系也可以看到糖基化變體，重要的是，糖基化的差異可對(duì)FcR結(jié)合產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響，從而對(duì)mAb治療效果產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。因此評(píng)價(jià)一個(gè)候選藥物，其與靶點(diǎn)分子的結(jié)合能力是基礎(chǔ)也是重要的一方面。在研發(fā)過(guò)程中不論小分子藥物還是大分子藥物的研發(fā)過(guò)程中均會(huì)使用親和力(affinity)來(lái)評(píng)價(jià)候選分子和靶點(diǎn)分子之間結(jié)合的強(qiáng)弱。

本期內(nèi)容：

  目前進(jìn)行抗體親和力檢測(cè)的方法有很多種，如平衡透析、硫氰酸鹽洗脫法、表面等離子共振技術(shù)（SPR）以及流式細(xì)胞術(shù)等。其中流式細(xì)胞法因?yàn)榭梢栽隗w外使用表達(dá)特定抗原靶點(diǎn)的細(xì)胞來(lái)評(píng)價(jià)抗體與細(xì)胞膜表面靶點(diǎn)的親和力，模擬出更接近體內(nèi)的抗體結(jié)合條件，因此越來(lái)越得到研究者的青睞。本文就以阿達(dá)木單抗（阿達(dá)木單抗是一種人腫瘤壞死因子TNF-α特異性重組IgG1單克隆抗體,對(duì)體內(nèi)腫瘤壞死因子TNF-α 具有高度親和力）為例介紹如何通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)來(lái)進(jìn)行阿達(dá)木單抗與細(xì)胞膜結(jié)合型TNF-α親和力評(píng)價(jià)的方法。

  實(shí)驗(yàn)流程如下：

1. 準(zhǔn)備穩(wěn)定表達(dá)膜型TNF-α的工程化CHO-K1細(xì)胞，培養(yǎng)至80%融合后收集，離心后用PBS洗滌及重懸，后用含有1%馬血清的PBS調(diào)整濃度至4x10⁶個(gè)細(xì)胞/mL;

2. 取流式管然后分別標(biāo)記為自發(fā)熒光（AF），TNF-α組，同型對(duì)照（ISO），缺少阿達(dá)木單抗組（WA）以及3-700 ng/mL 不同濃度的阿達(dá)木單抗組；其中AF組為不染色的CHO-K1細(xì)胞， TNF-α組為只有TNF-α APC抗體染色的細(xì)胞，ISO組為只加了阿達(dá)木單抗的細(xì)胞，WA組為只加了IgG PE抗體染色的細(xì)胞，阿達(dá)木組為分別加了不同濃度的阿達(dá)木抗體后進(jìn)行IgG PE染色的細(xì)胞；

3. 根據(jù)下表的要求進(jìn)行染色和上機(jī)操作

結(jié)果及分析：

  首先，通過(guò)設(shè)門(mén)策略圈出需要分析的單個(gè)CHO-K1細(xì)胞（Fig A and B），然后進(jìn)行相應(yīng)通道的平均熒光強(qiáng)度（MFI）的比較。根據(jù)AF組與TNF-α組在APC通道上MFI的結(jié)果可以確定該CHO-K1細(xì)胞確實(shí)表達(dá)m TNF-α (Fig.1 C); 阿達(dá)木單抗組在PE通道的熒光強(qiáng)度增加表明IgG-PE可以與阿達(dá)木單抗進(jìn)行特異性結(jié)合，這些結(jié)果證實(shí)了該生物模型和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)方法在體外評(píng)價(jià)阿達(dá)木單抗與靶細(xì)胞的結(jié)合是合適的。

Fig.1

  其次，分別計(jì)算3-700 ng/mL不同濃度的阿達(dá)木單抗組在PE通道的MFI (Fig.2 A), 然后通過(guò)不同濃度的MFI增加倍數(shù)以及阿達(dá)木單抗?jié)舛?/span>(Log)用Graph Pad Prism軟件（在四個(gè)或五個(gè)參數(shù)的邏輯模型下測(cè)試）進(jìn)行曲線擬合（Fig.2 B）即可得到流式檢測(cè)阿達(dá)木單抗-mTNF-α復(fù)合物的結(jié)合量效曲線。

Fig.2

  流式細(xì)胞術(shù)不僅可用于與細(xì)胞表征和功能相關(guān)的檢測(cè)，也適合作為生物測(cè)定中的檢測(cè)方法。在生物測(cè)定中使用流式細(xì)胞儀的優(yōu)勢(shì)在于自動(dòng)化，靈敏度，染色控制和自我校準(zhǔn)，可以獲得準(zhǔn)確一致的測(cè)量結(jié)果。該生物測(cè)定的開(kāi)發(fā)和驗(yàn)證的集體結(jié)果表明，它可以作為QC實(shí)驗(yàn)室中常規(guī)方法，或作為阿達(dá)木單抗的表征和生物相容性的測(cè)試。并且該實(shí)驗(yàn)條件可以標(biāo)準(zhǔn)化用于評(píng)估其他生物分子通過(guò)相同的機(jī)制行動(dòng)起作用并有助于擴(kuò)展流式細(xì)胞儀在生物標(biāo)記表征和生物仿制藥可比性證明中的應(yīng)用。

  如需要進(jìn)一步了解實(shí)驗(yàn)方案，請(qǐng)通過(guò)點(diǎn)擊左下角“閱讀原文"的信息與貝克曼庫(kù)爾特公司的技術(shù)支持聯(lián)系。

本文所列方法和數(shù)據(jù)參考以下文獻(xiàn)：

Camacho-Sandoval R, Sosa-Grande EN. Development and validation of a bioassay to evaluate binding of adalimumab to cell membrane-anchored TNFα using flow cytometry detection. J Pharm Biomed Anal. 2018 Jun 5;155:235-240. doi: 10.1016/j.jpba.2018.03.057.