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分選技術(shù)新突破：純度與得率的全面提升
Q
為什么CytoFLEX SRT分選能夠達(dá)到這么高的純度與得率？儀器這么小的體積，分選細(xì)胞的得率卻比以前的‘大塊頭’明顯高很多，我感覺以前分選準(zhǔn)備那么多細(xì)胞好浪費。
這是許多體驗過CytoFLEX SRT的用戶的共同疑問。今天，讓我們揭開CytoFLEX SRT優(yōu)質(zhì)分選性能背后的秘密，了解它如何通過雙域精準(zhǔn)DCD計算實現(xiàn)分選純度和得率的全面提升。
分選液滴延遲（Drop Charge Delay，DCD）的重要性
在細(xì)胞分選過程中，分選液滴延遲（drop charge delay，DCD）有時也被簡寫為（drop delay，DD），是指從被檢測顆粒通過激光檢測點，到形成分選液滴斷裂點（break off point，BOP）并施加電荷之間的時間延遲，這一時間延遲通常以“cycle（周期）"為單位表示。這是因為液滴的形成是由分選振蕩頻率與振幅共同決定，液滴形成的過程被分為若干周期或循環(huán)（cycle）。在BOP處，液滴開始與液流斷開，帶著相應(yīng)的電荷，經(jīng)過電場偏轉(zhuǎn)進(jìn)入收集管中。DCD的準(zhǔn)確性對于確保目標(biāo)顆粒被正確地偏轉(zhuǎn)到收集容器中至關(guān)重要。若DCD設(shè)置不準(zhǔn)確，目標(biāo)顆粒可能會被錯誤地分類為廢液，導(dǎo)致分選回收率和純度下降。
Rmax全面的分選質(zhì)控
Rmax（maximum expected recovery）是一種用于評估細(xì)胞分選儀性能的系統(tǒng)方法，通過計算樣本在未分選部分中損失的目標(biāo)細(xì)胞百分比，來確定分選回收率的最大值。與僅依賴純度的評估方法相比，Rmax提供了更全面的分選性能評估，特別是在分選效率和回收率至關(guān)重要時。
一般的分選后質(zhì)控，會將分選細(xì)胞進(jìn)行簡單的回測，檢測純度，但實際上會忽略掉分選得率。分選得率相較于分選純度，更容易受分選液滴延遲的影響。
傳統(tǒng)技術(shù)的局限
傳統(tǒng)的分選液滴延遲只是機(jī)械地使用微球進(jìn)行簡單估算，估計出大致的DCD分布區(qū)間，最終確認(rèn)可能的最佳值。但是由于分選過程涉及細(xì)胞在不同域中的流體動力學(xué)表現(xiàn)，從流動室內(nèi)到接近噴嘴，再到噴嘴通過，這些都會影響DCD的準(zhǔn)確性。
在流動室內(nèi)，鞘液形成的流體動力學(xué)聚焦過程中，細(xì)胞距離中心軸的位置不同，其流體速度也不同?？拷室毫鞯募?xì)胞加速較慢，而位于中心軸的細(xì)胞加速較快。通過噴嘴后，由于動量守恒，速度方程又會變化。
因此，有些儀器雖然能夠通過微球自動估算出DCD的值，但卻與Rmax的最佳解存在較大誤差。例如，Rmax方法獲得的最佳DCD，得率可以達(dá)到90%，但自動計算獲得的DCD雖然對純度沒有影響，卻導(dǎo)致得率下降。
創(chuàng)新的雙域精準(zhǔn)DCD計算方法
CytoFLEX SRT采用了一種創(chuàng)新的雙域精準(zhǔn)DCD計算方法，結(jié)合了時間域測量和空間域分析，確保了計算的精確性和可靠性。
時間域測量（DD1）
首先，CytoFLEX SRT通過測量QC微球從激光觸發(fā)點到專用激光點的行進(jìn)時間來計算DD1。QC微球是標(biāo)準(zhǔn)化的校準(zhǔn)顆粒，能夠提供一致且可重復(fù)的測量結(jié)果。這一步驟確保了初始測量的高精度和可靠性。
空間域分析計算（DD2）
接下來，CytoFLEX SRT基于高精度圖像分析，通過高速攝像技術(shù)捕捉液體射流在BOP處的斷裂和形成液滴的過程。通過分析這些圖像，能夠精確計算從QC微球經(jīng)過專用激光點到BOP的剩余時間。高精度圖像分析能夠捕捉到微小的時間變化和液體射流的動態(tài)變化，確保了更高的時間測量精度。
雙域精準(zhǔn)DCD計算的優(yōu)勢
1
提高分選精度和回收率
通過雙域精準(zhǔn)DCD計算，CytoFLEX SRT確保分選儀在最佳條件下運行，從而大幅提高了分選的回收率和精度。準(zhǔn)確的DCD設(shè)置，使得目標(biāo)顆粒能夠被更有效地偏轉(zhuǎn)到收集容器中，減少了樣品浪費。
2
實時監(jiān)控和調(diào)整
圖像分析提供了實時反饋，允許在分選過程中動態(tài)調(diào)整DCD。即使在樣品條件變化或儀器狀態(tài)波動時，也能確保分選儀始終在最佳狀態(tài)下運行，進(jìn)一步減少誤差。
3
減少實驗誤差
自動化的雙域精準(zhǔn)方法減少了環(huán)境與樣本等因素的干擾，通過標(biāo)準(zhǔn)化的操作步驟和自動化計算，保證了測量結(jié)果的一致性和準(zhǔn)確性。
結(jié)語
通過采用創(chuàng)新的雙域精準(zhǔn)DCD計算方法，CytoFLEX SRT不僅在分選純度和得率方面取得了顯著突破，還實現(xiàn)了分選過程的自動化與智能化，讓流式分選變得竟然如此簡單。2024年CytoFLEX家族迎來十周年，我們持續(xù)為科研人員提供更加高效和可靠的工具。未來，我們期待更多用戶能夠體驗到CytoFLEX SRT帶來的優(yōu)質(zhì)性能和便利，加速科研前沿的探索。
參考資料
1.PEREZ‐GONZALEZ, Alexis, et al. Evaluation of Sort Recovery via Rmax. Current Protocols, 2024, 4.2: e986.
2."Method and apparatus for compensating for variations in particle trajectories in electrostatic sorter for flowcell cytometer" (控制液滴可控充電并與載運流體斷開的時間點的的方法以及細(xì)胞儀系統(tǒng)) -編號: CN101675334B,持有人: 貝克曼庫爾特公司 (Beckman Coulter, Inc.)
3."Flow Cytometer Sorter" - 編號: US8889072B2,持有人: Beckman Coulter, Inc.
